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此前，“袁来云云”专栏就LBA定量要领的羁系验证睁开了第一、二期的详细先容，本期将延续前两期的内容，继续分享后续相关内容。
1.细密度和准确度
在要领开发之前或时代，应确定最低可接受的准确度和细密度，并在该剖析要领的生命周期内使用，同时应用适当的统计要领盘算运行内和运行间的细密度（precision）和要领准确度（平均误差mean bias）。表 VII A 中提供了适用于要领开发和研究前验证数据盘算的示例，表 VII B提供了相关公式。
表 VII A . 准确度和细密度的示例。重复多孔剖析的效果来自一个卵白药物的免疫剖析数据。在Excel电子表格中，使用方差剖析（ANOVA）盘算了相关统计效果。所有数据的符号体现法在表VII B中列出。
表 VII B.表VII A.中数字示例的符号体现法
运行内细密度：从盘算的运行平均值，估算测定浓度值的混淆运行内标准方差（SW）。总随机误差，通常称为运行间细密度（或中心细密度intermediate precision），从所有运行的累积平均值，估算所有测定的浓度值的标准方差（）。如泛起后一个标准方差稍微低估了真正的运行间的非细密度（imprecision），使用方差剖析（ANOVA），则能够盘算更准确的数值 （SIP）（见表VII A）。
要领的准确度（体现为%RE）由加权样品平均值（weighted sample mean）与样品标称参考值μT（sample nominal reference value， 50ng/mL in表VII A）的百分比误差（percent deviation）确定。当所有剖析运行的重复孔数相同时，加权平均值（weighted mean）和样品总体平均值（ sample overall mean）相等，将标准方差除以样品标称值，即得出细密度，以%CV作单位纪录。
在某些应用场景中，例如当基质中保存内源性化合物且无法剔除时，则没有标称值可用；因此，必需用盘算出的样本平均值替换%CV盘算中的标称值。在这种情形下，在验证之前，还必需科学合理地盘算接纳率，并将其用于评估准确度。
在要领开发的早期，可以盘算校准品的%CV清静均RE，展望该剖析要领可能抵达的细密度和准确性的最佳值。
要获得预期剖析性能更可靠的评估，可以自力制备特另外加标比照样本组，并至少举行3次剖析运行。所制备的样品的浓度应包括校准品的整个规模（例如，6至9个浓度点），对每次运行中的每个浓度点，至少举行复孔（duplicate）测定。由内插盘算得出的样品浓度，将反应来自校准品的变异性、来自样品制备和位置等其他因素的变异性。表VI中所建议的每个浓度的累积 %CV和绝对平均RE（平均误差mean bias）的目的限度为20%（LLOQ为25%），这与研究前验证评估时的细密度和准确性的目的限度相同。
在研究前验证时代，可通太过析验证样品确认要领细密度和准确性。在预期未知样本的基质中，制备5个或更多浓度的验证样品如下：预期的定量下限（LLOQ）、小于LLOQ的1/3的浓度、中浓度、高浓度和预期的定量上限（ULOQ），建议再举行最少6次剖析，对每次运行的每个样本至少举行2次自力剖析(复孔)。关于每个验证样品，应使用适当的统计要领一起剖析所有运行的复孔测定值（请参阅表VII）。
如以为要领可以接受，建议运行间细密度（%CV）和绝对平均误差（%RE）均须 ≤20%（LLOQ 为25%）。别的，建议将要领总误差（%CV和绝对%RE的总和）定为≤30%（LLOQ为40%），以切合研究中验证的接受标准。
每个研究中运行的细密度和准确性是通过评估QC样品的剖析效果来监控的。关于色谱类和LBA要领都接纳同样的运行接受标准：每个运行至少需要2/3的QC抵达对应的标称参考值的特定百分比（例如15%、20%、25%或 30%）；至少50%QC样品的剖析效果在指定的限度规模内。关于古板小分子药物的定量剖析，一样平常接纳4-6-15规则，相比之下，在2000年3月的AAPS钻研会上，建议对大分子的LBA制订4-6-30规则，本文建议接纳4-6-30 规则。
建议接纳研究前验证部分中形貌的细密度和准确度的接受标准，因其盘算简朴，并与上述研究中的4-6-30 规则相当一致。凭证界说，4-6-30 的接受标准仅基于单个定量效果与其标称值的误差，而不是基于盘算的平均值或标准方差，由于剖析效果与标称值的误差包括随机误差和系统误差，因此它是一个总误差的怀抱（图4）。
图4. 定量剖析效果总误差（z）的说明。总误差界说为剖析效果与其标称“真实”值 (μT)的误差（deviation）。一样平常假定匀称样品的重复测定效果的误差听从钟形的正态漫衍。为便于较量，误差通常体现为百分比相对误差 (拜见图中刻度)；盘算要领是将误差除以标称值，再乘以100。总误差即是系统误差的总和（systematic component，由盘算出的剖析平均值与标称值的误差来预计），再加上随机误差（random component，由一个剖析效果与剖析平均值的误差来预计）。
附加的研究前验证的限制条件，即%CV和绝对%RE的总和≤30%，以避免接受具有高度不细密（imprecision）和高度误差（bias）的剖析效果(例如靠近20%)。这样的剖析要领往往不可通过4-6-30标准。其它确保研究前和研究中接受标准之间的一致性的统计要领亦可接受。
关于免疫测试和其它LBA要领，其定量规模应基于最低（LLOQ）和最高（ULOQ），知足目的细密度和准确度标准的验证样品，而不是校准品的性能。
用于界说定量规模的验证样品是在未稀释的样本基质中制备的。在剖析之前，它们可能需要举行最低限度的稀释（minimal required dilution，MRD）。在需要使用 MRD 的情形下，可以将定量规模界说为纯粹基质中的标准浓度值，或者界说为应用 MRD 后获得的标准浓度值规模。例如在纯粹基质中，10至100 ng/mL 的校准曲线等效于应用倍数为10的MRD（即10%基质）之后，1到10 ng/mL的校准曲线规模。
在要领开发早期，可以使用回算的标准品浓度值起源预计定量规模。稍后，则使用加标样品来优化之前预计的定量规模。在此阶段，在预期的LLOQ和ULOQ浓度周围剖析更多浓度点是有益的。精度剖面图有助于评估定量规模的预期极限（图5）。
应凭证外加待测物的验证样品（spiked validation sample）剖析效果的细密度和准确性来建设该剖析要领的定量规模。标准曲线应包括跨越预期的LLOQ和ULOQ的浓度。LLOQ 和 ULOQ 由最低和最高的验证样本决议，其细密度（运行间%CV）和准确度（绝对%RE）均≤20%（LLOQ为25%），两者的总和≤30%。
在研究前验证时，确定的定量规模是在须要时，样本稀释后必需抵达的规模。对高于ULOQ的样本，必需增添稀释的倍数后重新剖析。若是样本已抵达最低稀释要求，且低于最低定量限，则必需报告为＜LLOQ。在样天职析时代，若是对标准曲线的须要编辑导致没有标准品抵达或低于经由验证的LLOQ，则必需提升LLOQ。在这种情形下，需要将LLOQ上调到其余标准品中的最低浓度。
在研究前的验证中，必需证实待测物在样本基质中的稳固性。稳固性试验应尽可能模拟研究样本的网络、贮存和处置惩罚的条件。通常是将待测物添加到全血（whole blood）以及经由处置惩罚全血获得的基质，如通过血浆（plasma）和/或血清（serum）举行评估的。对制备和贮存条件的评估，通常包括事情台稳固性（bench-top stability）、短期和恒久稳固性以及多个冻融循环的稳固性。在确定操作条件时，应思量剖析物的理化性子，还必需建设待测物的初级标准溶液在相关存储条件下的稳固性。
稳固性样品必需与在与收罗到的研究样内情同的基质中制备。若是使用剥离或改变了的基质制备研究前校准样品和QC样品，则仍必需在未改变的基质中制备稳固性样品。在剖析要领开发历程中，制备稳固性样品对研究前验证时代的中、恒久稳固性数据的网络有极大的起劲作用。因此，在合适的实验室中尽早制备稳固性样品并生涯相关文档纪录，可以为建设待测物的恒久稳固性提供一个优异的起源。稳固性评估可在要领开发历程中的样本处置惩罚阶段举行，包括但不限于对基质稳固性的评估：如室温、冻融循环等，以确定在剖析要领的整个生命周期中如那里置样品。
正式的稳固性评估必需在研究前验证中使用已建设的剖析要领举行。制备稳固性样品时，必需将待测物加入到与研究样内情同的基质中，以爆发高/低浓度的稳固性样品，这些浓度可以与高/低QC浓度相同。建议使用与QC样品相同的重复孔数来剖析稳固性样品。
评估事情台稳固性时，要求处置惩罚样品的要领与样本网络（研究）和剖析现场的处置惩罚要领相同，并且应在室温(至少2小时)和冰箱温度(2°至8°C)(至少24小时)下举行。研究职员可将剖析物加入新鲜收罗的全血来评估其全血稳固性。
以评估全血待测物稳固性为例，全血样品中加入剖析物，孵育2小时，每隔一段时间举行样本处置惩罚以获得血浆或血清；之后，监测处置惩罚后样品的接纳率的趋势来评估其稳固性。
关于冻融稳固性评价，应思量在通例剖析中预期的冻融循环次数。标准的要领是3次冻融循环，每次解冻距离不少于12小时。冻结息争冻的速率和冷冻贮存的温度应该模拟样品在剖析前解冻时的处置惩罚方法。评估恒久的稳固性必需思量到样本在研究现场和测试设施的贮存。在研究的整个生命周期中，包括研究样本的剖析完成之后，样本都必需是稳固的。测试的时间距离则取决于研究的需要，关于很是恒久的研究，测试频次以比样天职析更麋集，以确� ？梢苑峙纹饰鲅�，直到整个研究竣事。
关于生涯在-20°C和-70至-80°C样品是否需要举行稳固性举行研究，可能取决于样本在-20°C生涯的时间。若是在-20°C冷冻样本，在-80°C贮存，那么稳固性样品应该以同样的方法制备，在-20°C生涯的时间可以建模，以展望其稳固性。
新鲜制备的标准校准曲线和QC样品（无论是在可接受的失效期内或新鲜制备的），可以作为稳固样品的较量标准。除了全血稳固性外，稳固性的接受标准与用于QC样品准确度和细密度的接受标准相同。若是稳固性样本的测定值在细密度的接受标准之内，那么样本就被以为是稳固的，即便视察到稳固性转变的某种趋势，可以接纳其他评估要领，如使用置信区间。在这种情形下，当视察到的稳固性样品的浓度或响应凌驾了置信区间的低端，则该样本不再有用。
通常在研究中验证时代，会继续举行稳固性评估。若是研究样品的处置惩罚和贮存条件爆发转变，则必需举行特另外稳固性评估，以反应新的条件对稳固性的可能影响。若是无意中将样品贮保存差别的温度下，则应该在样品剖析之前举行该温度下的稳固性研究，以确认稳固性，并通过更新要领验证报告的形式举行书面体现。当一个时间点的稳固性数据批注样本失稳时，只要有一个预先建设的、确认稳固性趋势的计划, 则仍然可以在直到样品失稳的时间点以内的时间段举行样品剖析；若是下一个稳固性时间点的样天职析，反对了之前的样本稳固性趋势， 则可以延伸样本的稳固性区间。
由于许多免疫测试要领性子或名堂中的标准曲线定量规模(LLOQ到ULOQ)可能很窄，有时甚至<1个数目级。因此，有须要证实，当待测物的浓度凌驾定量规模（高于ULOQ）时，可以稀释样本，使待测物的浓度进入履历证的定量规模。举行稀释实验的另一个缘故原由是为了识别可能保存的“prozone”或“钩状效应”(拜见图6所示，即由高浓度待测物引起的信号抑制)。
稀释线性（dilutional linearity）不应与平行性（parallelism）相混淆。平行性必需使用incurred sample，即已测样本再剖析的真实样本，举行评估，而稀释线性可以使用外加待测物的QC样品举行评估。若是在研究前的验证中显示出稀释线性，那么在研究中验证时就不需要使用系列稀释的QC样品了。
图6.钩状（Prozone）效应的演示。两个团结点EIA的典范S形浓度-响应曲线(●)，包括高浓度钩状效应。详细来说，高浓度的待测物爆发了低于预期的响应。若是没有钩状效应，如开环(○)所示，较高的待测物浓度将爆发 > ULOQ响应；若是没有钩状效应，曲线的量化规模在LLOQ和ULOQ之间。LLOQ和ULOQ之外的锚定点仅用于曲线拟合。
稀释线性应在外加待测物到样本基质中和随后稀释而制备的样品上举行评估。该基质可以是单个样本或单个样本的混淆物。选择混淆样本和单个样本取决于来自基质的物质，如嗜异性抗体（heterophilic antibody）或团结卵白（binding protein）。稀释倍数应使若干个稀释后的浓度落在标准曲线的定量规模内。
在评估稀释线性时，应接纳比ULOQ大100至1000倍浓度的加标样品；若是不可行时，应起劲使其浓度尽可能地高。制备的稀释样品应包括ULOQ以上的浓度(用于评估钩状效应)，以及校准曲线的高、中、低浓度（用于评估稀释线性）。通常情形下，单次稀释的倍数不凌驾1:100。
当稀释线性度缺乏时，必需建设合适的剖析高浓度样本的战略。在报告测定效果之前，使用MRD或一个平台值（plateau value）可以知足这种需求。当无法实现稀释线性时，也必需建设数据报告的战略，例如在校准曲线的定量规模内接纳最大的稀释倍数。
在要领开发时建设的稀释计划应在研究前验证中加以确认，需要回算每个单次稀释后的浓度，并盘算经由所有稀释次数的最终浓度的累积细密度。每个稀释后样本的回算浓度应在标称值（nominal value）或期望值（expected value）的20%以内，累积回算浓度的细密度也应当≤20%。理论上，所制备1000倍于ULOQ的稀释线性样本应当获得一个大于ULOQ的回算值，但若是回算值在定量规模内，则可能保存钩状效应（图6）。
研究前的验证历程通�；崃盅芯垦镜乃邢∈凸婺�。当研究样本需要稀释的浓度凌驾研究前评估的浓度时，应重复稀释线性度研究，以涵盖该浓度。另一种要领是可以包括一个稀释QC样品，以确认稀释后可以准确地测定其浓度。
平行性是剖析要领的一个性能特征，通常在研究中验证时代举行评估。它在看法上类似于稀释线性，但使用现实研究样本或研究中爆发的代表相同基质和待测物（待测物）组合样本时，可对多次稀释举行评估。
通常不会在要领开发的历程中评估平行性，而是将稀释线性度用作平行性第一阶段的评估。
在临床前研究中验证剖析要领时，有时可以从袒露于高剂量待测物的动物试点研究中获得样本。这种类型的样本可以在研究前验证中评估平行性。别的，当验证一个剖析要领替换另一个要领时，并且能获得含有相同药物（药物活性因素）的研究样本时，也可以在研究前验证时代评估平行性。
可以使用一个研究中的血药峰浓度（Cmax）样原来评估平行性，常用的要领之一是将几个Cmax样本混淆，以天生一个平行性验证样品。评估混淆样本的平行性可以阻止使用单个研究样本而爆发的多个数值� ？梢越邮艿牟黄叫行匀【鲇谄饰鲆斓脑て谟τ�。作为一个目的，建议稀释的系列样品之间的相对标准误差（%CV）≤30%，同时对样品稀释效果非线性（即非平行性）情形预先设定报告效果的程序。
稳健性/耐用性的要害是解决在标准实验室条件下和在现实生涯转变的情形下该剖析要领是否有用的问题。虽然关于怎样确定稳健性和耐用性之间的绝对差别可能保存相当大的争议，但这两个参数都是在差别条件下该剖析要领重现性的指标。而它们被脱离形貌，只是为了更清晰地界说，怎样在剖析开发和验证生命周期的差别阶段对其举行评估。
要领的稳健性取决于在实验了可能影响剖析要领的转变时，其效能（performance）的一致性（consistency）。因此，必需重视、测试和纪录这些转变。对一个剖析要领有影响的转变必需在要领程序或要领SOP中明确纪录，可能影响免疫剖析要领的一致性的因素包括：孵育温度、光袒露(ELISA)和基质的选择(血浆、血清、脑脊液)。
一个剖析要领的耐用性（ruggedness）是在实验一样平常转变而导致差别操作条件的情形下该要领的一致性。剖析职员的转变、差别仪器的使用、运行的大�。╞atch/run size）、日期、时间或其他情形因素的转变对剖析要领一致性或耐用性的影响较小。
在要领开发时代, 评估的运行变量包括但不限于：孵育时间（剖析要领的所有办法）、孵育温度（所有办法）、差别的剖析职员和用来举行剖析的仪器（移液器、移液事情站、洗濯仪、读板机等）。在研究前验证中，有可能重新评估这些变量的一部分，但主要的是确保在剖析要领最终确定之前对它们举行评估，以便设置这些参数的限制规模，并举行要领验证。
在研究前评估要领的稳健性和耐用性时，应实验评估在研究阶段可能影响剖析要领的执行和效能的种种条件。
在研究竣事时，对QC一连监测的效果以及对运行内/运行间的细密度的评估，可以提供在差别条件下该剖析要领的稳健性和耐用性的信息。例如，应允许孵育时间有15%的转变（2h ± 15 min），以顺应在通例样天职析时此类情形爆发的状态。
要领验证一样平常可以分为三大类:周全验证、部分验证和交织验证。对本文所述的任何新要领都要举行周全验证，这个历程涉及要领开发、研究前验证和研究中验证。在动物物种（例如从大鼠到小鼠）和物种内的基质爆发转变（例如从大鼠血清到大鼠尿液）时，需要对剖析要领举行周全验证。
当要领变换较小时，可以举行部分验证；这其中包括要领转移、抗凝剂的改变（如EDTA、肝素钠、柠檬酸）、要领的转变（特殊是要害试剂如主要抗体或次要抗体）、样品处置惩罚历程的转变（如，血液离心转速，网络容器，贮存条件）、样品体积、浓度规模的增添、选择性问题（同时用药）、剖析职员资格的认证等。部分验证的规模可以很宽，从运行内准确度和细密度的简单评估，到近乎周全验证。更改试剂批次或样品处置惩罚要领可能只需要一次运行。相比之下，剖析要领转移可能需要大宗的实验。
要领转移是在一个实验室（要领发出实验室sending laboratory）建设一个剖析要领并转移到另一个实验室（要领吸收实验室receiving laboratory），并且至少需要部分验证的情形。
除了所需的纪录文件（例如要领形貌、验证报告、剖析证书/certificate of analysis）外，要领发出实验室还应提供影响耐用性因素的相关信息（例如，要害试剂和物料）。需要制订妄想或计划来确定要领转移流程（例如，要举行的实验）和接受标准。
一旦要领转移通过验证，一个理想的做法是让要领发出实验室和吸收实验室剖析30个笼罩标准曲线规模的加标盲样以及30个混淆的、用于已测样品再剖析的样品，并使用统计等效测试对两组数据举行较量�；蛞嗫梢允褂蒙潭ǖ目山邮芄婺＝狭苛阶槭葜涞牟畋�。
当在统一研究或申报质料中的数据是通过两种验证过的生物剖析要领获得时，需要举行交织验证。例如两种验证过的生物剖析要领是ELISA和BiaCore，或者是ELISA和液相色谱/质谱，建议使用测试样品（test sample，加标样品和/或混淆的已测样本再剖析样品）举行交织验证。
在要领开发历程中，不应设定明确的运行接受标准。对标准曲线性能的早期评估可用于判断所选试剂和剖析名堂的适用性。
研究前验证中，应凭证标准曲线的接受标准而决议是否接受一个验证运行。对研究前验证样本则不设接受标准。例如，在准确度和细密度评估时代，不可由于验证样本的性能不佳而拒绝一个剖析运行；需要报告所有来自研究前验证运行的数据。在某些情形下，在盘算累积平均值之前，可能会有由于可以确定的缘故原由（例如，手艺问题）而剔除某些验证样本的数据点；但这应该在整个验证研究竣事时举行，并且必需凭证文档纪录的要求纪录。
关于每个研究中验证运行，标准曲线必需知足相关接受标准。关于大分子LBA要领，所建议的运行接受标准（见有关准确度和细密度的章节）要求：至少6个QC效果中有4个（67%）必需在其标称值的30%以内，每个QC浓度级别至少有50%的数值知足30%的限度。本文所推荐的4-6-30规则同时对所允许的随机过失（不准确度imprecision）和系统误差（平均误差mean bias）实验了限制。若是一个剖析要领要求QC最终接受标准差别于30%的标称值误差，则应调解关于细密度和准确度的研究前验证的接受标准，使运行间不准确度和绝对平均值RE之和的限度值即是修改后的QC的接受限度值。
LBA剖析要领的主要用途是支持生物药在各个研发阶段的药代动力学研究。若是早期充分地界说LBA定量剖析要领的每个组成部分，就应当能够天生精练的验证妄想和简朴明晰的验证历程。
如本文所述，一个典范的要领验证包括至少6次细密度和准确度的剖析，以证实要领效能的一致性（consistency）。在这些剖析运行中，可以确定其它一些参数，包括早期的稳固性、特异性、选择性和定量规模。标准曲线需要至少含有6个非零点的浓度，并需要评估其准确度和细密度。除了真实的纪录在案的剖析职员的过失外，不应该剔除任何剖析运行及其数据。验证样本界说了该要领的定量规模，低于LLOQ或高于ULOQ的数值无需报告。在6次验证试验中，验证样本用来确定多次运行的累积细密度和准确度。在验证时代，不应该剔除任何验证样本，以展示该要领的真实效能。
在样天职析历程中，要领验证的生命周期仍在继续。在接受QC样品的剖析效果之前，首先凭证预设的接受标准，确定标准曲线是否通过。只有当标准曲线通事后，才可以评估QC样品是否可接受；之后，再凭证QC的定量效果确定该剖析运行是否有用。QC的接受标准可基于4-6-×规则或总误差，并且可以基于要领开发和研究前验证阶段所使用的标准来展望。总而言之，LBA定量剖析要领是一种高迅速度的定量要领（通例可取得pg/mL级的迅速度），可用于生物基质中的卵白质和多肽生物药的定量剖析。
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