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本期《袁来云云》为系列文章《大分子生物剖析概论》的第八篇 ，旨在凭证已揭晓的文献资料 ，起源先容LBA中的质量控制样品（QC ，quality control）制备、认证（qualification）和批次一致性维护的相关看法和实践。
由于内容篇幅较长 ，本文将接纳上下篇形式举行推送 ，敬请垂注！《袁来云云》专栏系广州新2管理网登录入口医药微信公众号打造的科普学术专栏 ，内容均为新2管理网登录入口医药子公司深圳博瑞副总司理袁智博士原创。
配体团结测试要领（LBA）的性能 ，在研究前要领验证和研究中样天职析时代 ，体现在QC的效能。需要接纳严酷和既定的要领合理地管理QC样品的生命周期 ，内容包括制备、质量控制以及QC性能的监控。
虽然在羁系机构的指南和有关LBA的文献中有关于QC样品的制备和认证接受标准（acceptance criteria）的相关讨论 ，但此类文献只是较为起源地讨论了这些参数 ，且只涉及要领开发和研究前验证的阶段 ，并没有对QC生命周期管理的问题和对这一历程至关主要的因素做出讨论息争答。关于新QC批次的生产和认证（用来坚持QC批次间的一致性和避免测试效果偏移）的许多问题仍然没有获得解决。别的 ，大大都生物剖析实验室缺乏健全的要领或统计工具来监测QC趋势 ，而这种监测关于QC性能以及生命周期的管理是至关主要的。
本文旨在填补这一方面的空缺 ，为QC样品生命周期的管理及其组成部分提供指导、建媾和最佳实践。这其中包括：QC的制备、认证和其性能趋势的监控。资助生物剖析实验室 ，在其标准操作程序 （SOPs）中 ，界说QC的认证 ，并制订批次间一致性的指导原则。应当在已验证的剖析要领或每个实验室的样天职析妄想中 ，对研究和剖析要领特异性的详细要求（assay- and study-specific requirements）和规范加以思量和做出详细说明。本文主要着重于用于LBA定量和定性剖析中的QC ，如药代动力学（PK）和抗药物抗体（ADA）的测试。其他类别的测试要领不在讨论的领域。
标准品（Reference standard）、混淆样本基质、QC的组成因素、装备和生产战略都是制备用于LBA的QC样品的要害因素。以下各节将凭证这些因素睁开讨论。
QC样品应使用与研究样本基质相似 ，且尽可能与其靠近的基质来制备。例如 ，若是研究样本是未过滤、未离心或未经活性炭处置惩罚的血清 ，则QC基质也应是未过滤、未离心或未经活性炭处置惩罚的统一物种的血清。应使用未稀释（100%）的基质制备QC样品 ，以便对QC样品与研究样本接纳相同的稀释办法[如最低稀释度（minimum required dilution ，MRD）]。
但不扫除特殊情形 ，例如用替换基质取代有数的研究基质（通常很难获得足够数目的有数基质包括：脑脊液、枢纽腔滑液或来自某些物种的眼部基质（ocular matrices）等） ，但这需要适当的理由 ，并且只允许在需要保存基质（matrix conservation）的情形下使用�；航饣侍辶课侍獾耐萍鲆焓窃谔婊换手凶急�3个QC水平中的2个 ，而在研究基质中制备一个浓度的QC。若是使用替换基质 ，则需要证实其与研究基质具有等效性。最好使用与制备标准品（calibrators）相同批次的基质来制备QC样品 ，以增强要领的一致性和重现性。
中心原液（intermediate stock）是用于制备QC样品的待测物溶液 ，可以在下列稀释剂中制备 ，如水、缓冲液或有机介质（organic media）。当中心原液是水或缓冲液时 ，QC的最终因素至少为95%（v/v）的样本基质；当使用有机溶剂（如DMSO或乙酸）制备时 ，最终因素至少为99%（v/v）的样本基质。
应当划分制备QC样品与标准品 ，以避免加入待测物时的系统性误差。建议使用差别的中心原液和差别的稀释办法来制备QC样品和标准品 ，还建议在每个浓度中自力加入待测物 ，而不是通过序列稀释（serial dilutions）高浓度的QC样品。这一点尤为主要 ，由于标准品若是是通过高浓度样品的序列稀释制备的 ，序列稀释QC样品和标准品能够掩饰稀释线性度的问题 ，应该阻止这种操作。
在QC制备时 ，PK定量剖析中的标准品（reference standard）或ADA检测中的阳性比照品（positive antibody control）必需在其有用期内。应该单独建设QC样品的稳固性和有用期（与用于制备的标准品无关） ，由于QC样品中的待测物是在基质之中 ，与原液中的标准品是差别的。
可以制备、分装和贮存将标准品用研究基质或适当稀释剂稀释时所爆发的中心原液 ，以供未来制备QC样品或标准品。在这种情形下 ，中心原液的稳固性应笼罩其贮存窗口期 ，即从其制备日期起至使用日期为止。这可以通过较量下述2种样品来实现：1. 从冻存的中心原液（frozen intermediate stock）制备的标准品和/或QC样品；2. 使用初始的标准品原液（original reference standard stock）制备的标准品和/或QC样品。
准确地选择用于制备QC样品的基质 ，关于包管剖析要领的质量和避免剖析效果漂移是至关主要的。这在ADA检测中尤其主要 ，由于及格的基质（QMP） ，作为阴性比照（NC） ，将直接影响微孔板特异性的切点 ，必需在已验证的定量剖析要领中或适当的SOP中 ，建设并明确划定适当的基质筛�。╯creening）、选择（selection）历程以及接受标准。有关基质质量认证（qualification）的建议总结如下。
第一个及格基质的批次认证通常是作为剖析要领开发的一部分举行的 ，并在要领验证时举行正式的认证。
& 认证足够体量的及格基质 ，足以在多个研究和多个药物开发阶段一直使用。至少 ，有足够体量的及格基质可以知足研究前验证以及一项或多项生物样天职析研究。
& 及格基质的贮存条件与预期研究样本的贮存条件一致（如-20℃或-80℃）。
& 制备混淆基质（matrix pool）的第一步 ，是通过较量未添加和添加了待测物的基质样本所爆发的剖析信号 ，来筛选单个基质样本或混淆基质样本（多个、单个样本的混淆物）。
& 作为配景值 ，考察未添加待测物的基质样本的响应值。应当将配景异常高的基质样本剔除 ，例如 ，高于PK定量下限（LLOQ）或高于ADA预估切点的样本。关于ADA剖析 ，配景异常低也可能有问题。
& 关于PK定量剖析 ，可凭证剖析要领或实验室SOP中确定的接受标准来评估添加了待测物的基质样本。如建议相对误差（RE）的接受标准在±20%规模内；建议在LLOQ和低QC(LQC)之间的浓度水平上添加待测物到单个基质样本 ，并且至少在一次剖析运行中这样做。
& 关于ADA剖析 ，必需强调空缺信号（blank signal ，NC）的主要性。当没有其它批次的基质可较量时 ，建议在筛查测试(screen ，Tier 1)中评估单个基质样本 ，并较量组内各个样本的响应值 ，以评估其原始响应值。应将所有异常高响应值或低响应值的单个基质扫除在替换混淆基质（replacement matrix pool）之外。在可能的情形下 ，还应将混淆基质（matrix pool）与一组疾病状态的基质样本举行较量 ，以确定其适用性（suitability）。
& 关于PK定量剖析 ，混淆基质的配景的接受标准 ，可以是比预估的LLOQ低2-3倍的基质响应。ADA剖析的接受标准 ，可以是低于预估的切点或在特定的响应规模内。
& 使用与认证第一批次相同的剖析要领 ，对替换批次的基质样本举行认证。
–确保未外加待测物的现有的和替换的及格基质（QMP）的响应值具有可比性。
–关于PK定量剖析 ，应当将替换基质批次与现有及格批次举行较量。至少在一次剖析运行中 ，剖析添加了待测物标准品的样本（浓度在LLOQ和LQC之间 ，至少n=3）。标准品（reference standard）的剖析接纳率(AR) ，在现有和替换批次的基质中 ，都应在80至120%的规模内。同时 ，使用两个基质批次制备的样本所测定的标准品浓度之差不凌驾10%。
–为了认证ADA剖析中的替换及格基质（replacement QMP） ，应当使用先前建设的微孔板特异的切点因子 ，对单个基质样本举行筛查。筛查测试中是阳性的所有单个样本都应扫除在替换及格基质之外。另一种要领是直接考察每个基质样本的信噪比(S/N) ，应将凌驾经由验证的切点因子的基质样本扫除在替换及格基质之外。
以下推荐的是替换及格基质的接受标准: 替换基质批次的响应值 ，应当在现有基质批次响应值的±10%以内。若是不是 ，则应当评估一组单个基质样本 ，并与两个微孔板特异的切点较量 ，以确定筛查效果是阳性或阴性。其中一个切点是用现有及格基质的阴性比照盘算的 ，另一个切点是用替换及格基质制备的阴性比照盘算的。使用这两个切点（现有vs.替换微孔板特异的切点）所得出的筛查效果（阴性/阳性状态）应当相似（comparable） ，但borderline samples ，凭证基质响应 ，可能是阳性或阴性。
在PK剖析中 ，基质的配景响应应坚持在最低状态 ，由于它影响剖析迅速度 ，并可能限制订量的规模。关于ADA剖析 ，建议一旦获得验证数据 ，就应尽快确定基质响应规模的上限和下限。
& 在非竞争性定量（如PK）免疫测试中 ，基质配景不应凌驾LLOQ的1/3。
& 在竞争性免疫剖析中 ，配景值至少为最低校准点数值的1.11倍。这是基于B/B0（最低校准点信号/零校准点信号 ，lowest calibrator signal/zero calibrator）建议的90%（100/90）。
& 在ADA和其他非定量剖析中 ，对基质配景的一样平常建议是相对发光单位（RLUs）≤200和吸光度≤0.200。有些测试要领的基质配景则比上述建议的要高。
& 基质配景的下限由仪器响应决议 ，差别仪器和差别实验室的仪器响应可能差别。
& 用于制备QC样品的装备 ，包括移液器 ，应举行细密度验证 ，并应在校准规模内。
& 装备校准的历程和频率应在SOP中划定昭示。
& 在一些实验室 ，除了按期校准之外 ，还需要在使用移液器制备QC样品之前举行特另外校准检查 ，但在一些实验室 ，若是按期校准仍然有用 ，则不需要重新举行校准检查。
此处的一样平常运行接受标准适用于现有和替换QC批次的认证。此处下列术语：基线批次（baseline QC lots）、遗留QC批次（legacy lots）或QC较量批次（comparator QC lots）可交流使用。
1. QC样品可与之前认证过的 ，且有已知稳固性的冻存校准品举行比对和认证。若是没有及格的冻存标准品 ，则应使用重新制备的标准曲线对QC样品举行评估。在后一种要领中 ，需要加入之前认证过的一组QC样品对新鲜制备的标准曲线举行认证。
2. 认证（qualification）是通过评估剖析内和剖析间的细密度（inter- and intra-assay precision ，对所有要领）和准确度(对定量要领)来举行的。
3. 对定量和药代动力学剖析要领 ，QC样品必需知足细密度和准确度标准：变异系数(coefficient of variation ，CV) ≤20% ，RE在±20%之内；定量下限（LLOQ）和上限（ULOQ）：CV≤25% ，RE在±25%之内。
1. QC样品应知足CV≤20%的标准。
2. 现有和替换QC的响应值都应在其响应浓度级别已建设的响应规模内。若是替换的QC批次不在响应的信号规模内 ，则实验室必需扫除故障并确定其基础缘故原由。ADA阳性比照（PC）和阴性比照（NC）信号漂移的潜在缘故原由包括：(a)待测物添加过失；(b) 混淆基质选择不当；(c)信号规模设定不准确。
后续的故障扫除应遵照以下顺序: 首先准备一个新批次的QC样品 ，若是重复制备的QC仍然失败 ，则认证一个新批次的及格基质（QMP）；然后重新制备阳性和阴性比照 ，若是新制备的阳性和阴性比照仍然在其信号规模之外 ，则纳入研究中测试运行得出的特殊数据 ，进而重新评估已建设的信号规模。每个实验室应当凭证足够的测试运行次数所得出的数据 ，适外地确定验证后信号规模 ，以阻止将其规模设置得过窄或者不适合恒久使用。
3. 接受标准：高阳性比照（HPC）>低阳性比照（LPC）>切点>阴性比照。
1. 建议在每次认证的测试运行中 ，至少测试3组现有和替换QC样品。在这个要求上 ，个体实验室可能会有所差别。
2. 至少三分之二的测试运行应知足上述划定的接受标准。这些认证要求和建议见表I。
3. 现有的和替换的QC样品必需知足上述的通例运行接受标准。
4. 若是替换批次的QC样品不切合上述接受标准 ，而现有批次及格时 ，则应将替换批次破除 ，并制备另一批次的QC样品。当一个浓度水平的替换QC样本缺乏格时 ，可以重新制备该浓度水平的QC。
5. 若是现有的QC批次在替换批次的认证历程中未能通过接受标准 ，则应重新剖析以确认相关效果。若是现有的批次在重复剖析后仍然缺乏格 ，那么它就不可用作比对品（comparator）。在这种情形下 ，应遵照<现有及格批次不保存时的认证>章节所形貌的程序和质量标准。
第一个批次的QC样品 ，也被称为基线（baseline）或遗留（legacy）批次 ，通常作为研究前要领验证中的准确度和细密度（A&P）评估的一部分举行认证。对研究前要领验证中的QC批次举行认证时 ，推荐至少举行自力运行6次 ，每个QC浓度至少运行3次 ，至少分2天举行 ，至少2名剖析职员加入。且要求至少4/6的QC认证运行应该知足接受标准 ，才知足对该批次QC认证（见表1）。在可能的情形下 ，还建议将该QC批次与要领开发时所用的QC样品建设桥接联系。对这种桥接性评价的接受标准将由各个自力的实验室自行制订 ， 推荐二者之间的误差为±10%或更低。特定样品的运行接受标准必需知足通例运行接受标准。
i. 通过与现有及格QC批次较量的认证
在研究前的要领验证之外 ，每次制备替换批次QC样品时 ，通过与之前认证了的（及格）批次的较量 ，对替换批次举行认证。为了可靠地举行可比性评估 ，必需使用相同的冻存或新鲜制备的标准曲线来评估现有的和替换的QC批次。
一个替换批次的QC样品至少要经由2个自力的认证运行（qualification runs）。QC认证运行可能在统一天由多个剖析职员（至少2名） ，或统一剖析职员在差别天（至少2天）举行。建议在统一认证运行中 ，至少要包括3组自力的替换批次QC样品和至少3组现有批次的QC样品。一组从单独冻存和分装的QC所制备的样品被界说为一组自力的QC样品（一组有三个浓度级别）。在QC认证历程中 ，不勉励在统一测试运行中使用统一冻存和分装的QC制备的一组QC。个体实验室可以制订差别于此处建议的标准 ，如凭证其对所涉及的变异性和危害的评估 ，划分举行3次自力测试运行 ，而不是2次。
定量LBA要领中 ，替换QC批次的认证 ，应当以通例运行接受标准中的划定为基础 ，同时也应当以其与现有及格QC批次的可比性（comparability）为基础。例如 ，可比性标准可包括现有批次和替换批次之间±10%或以下的差别。使用现有和替换QC样品的丈量浓度 ，可以用下面的公式确定差别百分比值（%）。
替换批次浓度-现在批次浓度
用于ADA和其他非定量LBA检测要领, 现有和替换的QC批次都应该知足ADA和定性剖析的通例运行接受标准。别的 ，现有和替换PCs和NCs的响应都应该在各自建设的信号规模内。
ii. 不保存现有及格（认证过的）QC批次情形下的认证
可能保存这样的情形 ，即可能不保存遗留的 ，经认证及格的QC样品 ，由于这些QC样品已经用完或逾期。不保存可较量QC的情形下 ，建议使用差别的中心原液（intermediate stocks） ，由差别的剖析职员 ，划分制备两个批次的QC样品。从现实操作上 ，可以指定一个批次 ，可能是批量较大的 ，为主要批次（primary lot）；另一批次 ，可能是小批量的 ，就作为参照品（comparator） ，对主要批次举行认证。对主要和次要批次的比照测试应由2人举行 ，每人使用自力制备的标准曲线举行测试 ，每人举行3次测试 ，至少分2天举行 ，总共运行6次。至少4/6 (2/3)的QC认证运行应该知足接受标准。也应知足上述的通例运行接受标准。两个替换批次的QC样品应知足±10%或更严酷的误差标准 ，包管二者中任何一个批次均可接受。表1总结了这些认证要求。
在含有内源性待测物的基质中制备的QC的认证
在定量PK剖析中 ，当基质中含有待测物的内源性同源物时 ，所测定的空缺基质浓度可能是至关主要的；并应该纳入思量。有2种方法：
1.减法：在报告测定的QC值之前 ，从测定的QC样品浓度中减去空缺基质的浓度；2.加法：将测定的空缺基质浓度加上QC的外加待测物浓度 ，以确定其调解后的标称值。Marcelletti等人先容了几个案例研究；其中 ，使用加法和减法 ，直接较量了加标接纳率；这些案例研究评估了具有显着内源性水平的许多生物标记物的接纳率。凭证这些已揭晓的案例研究 ，减法是首选要领 ，而不推荐使用加法。建议在每个认证运行中至少包括3组空缺基质样本 ，其测定的平均浓度用于调解值（adjusted value）的盘算。建议对含有内源性待测物的QC样品 ，在10-20天内至少举行30次运行 ，至少有2人加入 ，每个运行使用≥3组QC样品。此类QC认证的运行接受标准与定量PK要领的通例运行接受标准相同。
未知标称浓度（Nominal Concentration）的QC的认证
若是QC原液的标称浓度未知 ，如未纯化的卵白质和一些商业泉源的比照原液（commercial control stocks） ，或者在血液学检测中 ，当crude血清/血浆被用作血液因子的泉源时 ，标称浓度必需凭证多位剖析职员在差别日期举行的多次运行中检测到的平均值来确定。
此类测试的适当规范是特异于测试要领的 ，必需作为研究前测试要领验证的一部分建设起来。QC样品的制备要领是将待测物原液 ，以特定稀释倍数 ，加入到经由认证（及格）的空缺混淆基质或适当的稀释剂（diluent）中。关于所有乐成的运行 ，每个QC的平均测定值就应设定为标称值。建议至少正常实验测试运行30次 ，由至少2人在10-20天内执行 ，以设定QC样品的标称浓度。每个测试运行包括 ≥3 组QC。在最初的测定之后 ，一样平常剖析运行中QC样品的接受标准以及未来替换QC批次的接受标准为已确定的标称值（nominal value）的±20%。任何替换批次的待测物浓度必需在此确定的规模内。由于来自血清和血浆的因子的固有的变异性 ，可能需要 ，基于最初的20-30次的运行数据 ，为每个QC浓度水平指定一个暂时的标称值；然后 ，在有其它可用数据时 ，重新评估这个标称值的适用性。若是测试要领的内在变异性较大 ，则可能需要按期地重新评估和重新建设QC的接受规模。前述的PK定量要领的通例运行接受标准也必需获得知足。
标称浓度与测定浓度单位纷歧致的QC的认证
酶活性测试要领是QC标称值和测定值单位差别的要领之一。在这些剖析测试中 ，酶类药物的标称(外加)浓度通常是ng/mL或?g/mL；然而 ，加标QC样品测定值的活性单位为nmol/h/mL或nmol/h/?g。这些QC单位上的差别组成了奇异的挑战 ，由于它不可盘算准确度。
在这种情形下 ，可以通过建设QC的标称活性值（nominal activity value）来战胜这个局限性。每个浓度级别的标称QC活性值可以 ，由至少2人 ，凭证至少30次及格运行的平均测定活性值 ，在至少10-20天内建设。每次运行至少应包括3组QC样品。所有及格运行的平均活性测定值 ，即为QC的标称活性值 ，并可以使用下面的公式盘算单个QC样品的%RE：
其中 ，标称QC活性值m30 ，寄义是举行30次运行所测定活性的平均值。在最初的测试完成之后 ，一样平常运行和替换QC批次的接受标准就是QC活性标称值的±20%。表2总结了上面讨论的 ，有关特殊类别的QC样品的注重事项。
表2. 对特殊种别QC样品的要求的总结
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