?此前，“袁来云云”专栏凭证已揭晓的文献资料，对PK定量要领的设计作起源先容（袁来云云 | 大分子生物剖析概论（十四_上）：LBA定量剖析双特异性生物药的挑战）。本期将延续上期内容，重点就相关案例剖析、重大药物分子的未来生物剖析手艺以及远景等方面举行探讨。
“袁来云云”专栏系广州新2管理网登录入口医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为新2管理网登录入口医药药物研究中心资深科学照料袁智博士原创。
案例剖析（Case studies）
以下案例研究是为了说明关于双特异性分子而言，生物剖析的奇异思量，其适用于在药物开发的差别阶段设计和实验定量生物剖析和PK评估。
案例剖析1：在非临床研究中定量总和完整双特异性药物并评估ADA对PK的影响。
化合物X是一种基于支架的针对两种细胞因子的双特异性抗体。起源数据批注，这种特殊的支架产品平台可以在非临床物种中高频率地诱导免疫原性。为了更好地诠释ADAs保存时的毒理学发明，生物剖析小组决议开发两种差别的PK要领来测定动物血清中的总药物和完整药物的浓度。总PK要领是使用两种抗体对支架的框架举行剖析。完整的PK要领是使用一种靶向细胞因子作为捕获试剂，另一种作为检测试剂�？梢允硬斓�，使用两种PK要领剖析相同的样品爆发的浓度与时间关系险些完全等同，除了在较晚的时间点之外，药物浓度很是低的时间，即完整药物浓度略低于总药物浓度的时间。
在这些时间点视察到的低浓度差别只爆发在少数受试者上。因此，ADA和生物转化（biotransformation）被以为是最可能的基础缘故原由。需举行一项研究以确定这种差别的基础缘故原由，如生物转化诱导的不稳固性，靶标滋扰（target interference）和ADA滋扰。为了验证这种双特异性分子的体内生物转化，例如，卵白质水解是否展现了影响稳固性的结构缺陷，故开发了两种配体团结质谱(ligand-binding mass spectrometry，LBMS)要领，使用抗人Fc免疫亲和捕获和靶目的捕获，然后举行分条理的质谱剖析。接纳与ESI-MS相团结的纳米级液相色谱法对非多种代谢产品举行了更高区分率的疏散和判断。
数据显示，生物转化的效果为阴性。ADA剖析批注双特异性分子比其母体药物的ADA泛起频率更高。只管随后通过免疫原性表征，证实大大都ADAs并非中和性ADAs，但发明ADAs有助于快速地扫除完整药物。这些数据也可以诠释为当药物浓度足够低时，内源性细胞因子占有了特定的捕获/检测位点，即保存靶标滋扰。效果批注，该药物在体内结构稳固。PK数据差别与完整药物的不稳固性无关，而更可能是由于ADAs高水平导致扫除药物的速率更快。
案例剖析2：一个F(ab’)2在体内生物转化为两个活性F(ab)单体的PK剖析。
本案例研究涉及一个双特异性F(ab’)2，由一个anti-VEGF arm和一个anti-Ang2 arm组成，用于玻璃体内注射（intravitreal administration）治疗视网膜变性疾病，如湿性晚年性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿。据报道，针对F(ab’)2抗体铰链区的，先前保存的内源性抗体(PEA)保存于很大比例的人群中。在未接受药物的食蟹猴和人血清样本中，都证实了这一点。移除这些预先保存的内源性抗体的铰链表位（hinge epitopes）使得该分子中只有单个二硫键将两个fab团结在一起。
因此，注射入玻璃体（其含有glutathione作为抗氧化产品的一部分，以包管晶状体的完整性）后，药物分子生物转化为individual Fabs，相关扫除率(t1/2 <1天)，通常比兔玻璃体的Fab (t1/2 约3天)或F(ab’)2 (t1/2 约3天)的扫除率要大(未揭晓的视察效果)。
备注：一样平常情形下，t1/2与扫除率的关系如下，即半衰期还取决于药物漫衍体积；若是假设漫衍体积恒定，则t1/2与扫除率之间的关系是确定成反比的：
因此，完整的F(ab’)2和individual Fab碎片均保存于眼腔(玻璃体和水相之中)和系统循环之中。正如所预料的，啮齿类动物脉络膜新生血管模子（rodent choroidal neovascularization models）显示，individual Fabs保存了生物活性。为了周全地形貌活性药物袒露量的特征，有须要定量这3种药物形式。因此，开发并验证了3种单独的PK定量要领。此前有学者一经思量过使用一种总PK定量要领来测定所有这3种形式。可是，该分子是一个新颖结构，故有须要剖析其生物转化的动力学，这关于形貌该分子体内的行为是很主要的。
定量完整待测物的ELISA要领使用牢靠的（immobilized）重组卵白Ang2捕获待测物，然后加入biotin-VEGF，最后加入streptavidin-HRP，是一个sequential sandwich名堂。外加待测物的接纳率实验证实这种测试名堂仅能够特异性地检测F(ab’)2，但检测不到两种Fab分子中的任何一个。定量两个Fab分子的要领都接纳类似的基本名堂：使用各自的靶标-Ang2或靶标-VEGF，从样本中捕获Fabs。然后加入biotin-sheep antihuman IgG的重链和轻链(H&L)，最后，加入streptavidin-HRP举行检测。
值得注重的是，接纳测定Fab的名堂，也可以检测到完整分子。只管使用Fabs作为标准品（standards）和比照品（controls），在剖析Fab时，也定量了完整F(ab’)2。别的，使用F(ab’)2和任何一个Fab的混淆物，可以通过从完整分子（高特异性）的定量效果中减去Fab效果来定量另一个Fab。已履历证了所有这些剖析要领，并用于兔血清样本的非临床研究，也认证了这些要领可用于食蟹猴的血清和水/玻璃体/视网膜的萃取物中药物的定量。血清定量剖析的另一个挑战是几个ng/ml甚至更低的药物浓度，这也是玻璃体腔生物药给药的一致特点：给药量很小(通常是<1 mg/eye)；药物在抵达系统循环时，履历了高倍数的稀释。
案例剖析3：在非临床研究中监测体内双特异性药物生物转化的总和活性（total and active）药物的定量。
一个针对肿瘤顺应症的双特异性单克隆抗体靶向两个细胞外貌的抗原，其药理作用取决于单克隆抗体的两个团结臂（both binding arms）的完整。然而，在体外生物物理表征历程中，在其中一个团结臂中发明了翻译后修饰(post-translational modification，PTM)的问题。但这种PTM，不可在不显著损害生物活性的情形下，通过卵白质工程而扫除，由于在不稳固的氨基酸上的点突变（point mutation）会完全破损单抗与靶标的团结。别的，仅具有第二个团结臂功效的药物变异体的累积，可能会屏障活性药物团结第二个靶点，并可能在多次给药后诱发毒性反应。
对该单抗体内生物转化的特征举行研究是势在必行的，如转化的动力学和水平，这可以为进一步开发该单抗提供指导。随后，使用与分子的Fc部分特异性团结的测试试剂开发了一个桥接名堂的总药物PK定量要领，辅之以一种活性药物PK定量要领：纵然用靶标卵白作为PTM-liable functional domain的捕获试剂，使用抗人Fc试剂作为检测试剂。使用野生型和拥有点突变的药物的混淆比例，活性PK要领，在总药物保存的情形下，能够区分和准确测定活性药物的百分比。之后，评估了该药物分子在食蟹猴上的PK特征。使用了总和活性PK定量要领来测定研究样本中总和活性药物的浓度。实验数据证实，体内样品中的药物泛起了PTM，并且活性药物浓度百分比随时间而降低�；诮：头抡�，可以在临床研究中镌汰剂量距离来减轻活性药物浓度的降低。非临床研究效果有助于决议使用活性PK定量要领作为支持临床研究的主要要领。而在FIH研究中，总PK定量要领可用于进一步形貌无活性药物变异体（inactive drug variants）潜在的累积及其对PK/PD和毒性的影响。
重大药物分子的未来生物剖析手艺
如表1中所总结的，一样平常需要多种PK定量要领和ADA要领评估ADC和双特异性抗体的基础药代动力学和免疫原性。剖析要领数目的增添给样本的网络、贮存、运输、剖析和剖析要领的生命周期管理带来了重大的肩负。在某些情形下，由于样本数目有限，基础不可能举行多次剖析。关于增添的功效域和潜在的生物转化，仅仅增添剖析要领的数目以知足生物剖析需求似乎是一个直接的解决计划，但“两点式two-point”团结要领（如夹心式LBA）并不适合评估具有多域（>3）结构的分子“完整性intactness”。只管免疫捕获（IC-）-LC-MS/MS要领在理论上可以识别来自多个功效域的特征肽，但有关“完整性”和功效的信息仍然缺失。因此，随着重大药物模式（complex drug modalities）的生物转化越来越受到的关注，定量LBA要领和（IC-）LC-MS/MS要领往往无法对潜在的生物转化提供相关信息。正如CovX-Body和基于框架（scaffold-based）的双特异性抗体的案例所批注的那样，PK行为的意外纷歧致触发了潜在生物转化的嫌疑，进而就需要新的剖析要领来进一步研究。
表1.ADC和双特异性抗体的PK定量要领（SCR，标准曲线规模；ECL，电化学发光；N.A.，不适用）
备注：表格中参考文献的标注不适用。
因此，使用multiplexed PK/ADA要领以测定完整药物、种种变构体（variants）和相关的ADA是很是需要的，同时，也对潜在的生物转化提供相关信息。Multiplexed检测要领已在团结疗法中有早期应用，但尚未看到对重大药物模式“biotransformation ready”的multiplexed测试要领，用以资助评估重大药物的完整性，表征种种生物转化，并测试对药物/药物变构体各部分的免疫反应。下文将简朴先容对重大药物模式有希望的两项生物剖析手艺：HR-MS定量剖析完整卵白质和毛细管Western Blot定量剖析。
HR-MS 定量剖析完整卵白质
与针对完整药物分子中某个选定区域的LBA和LC-MS/MS手艺相比，完整卵白质的定量剖析旨在将一个重大的药物分子作为一个整体来研究，这能够展现主要的高条理结构和生物转化的相关信息。完整卵白的LC-MS剖析通常用尴尬刁难生物转化研究的定性剖析。Murphy等人使用IC-LC Q-ToF MS，在CovX-Body双特异性抗体上发明并判别了卵白酶剪切掉的含有8个氨基酸的肽段。He等人使用高区分率的QTOF-MS与IC-LC相团结，乐成地在小鼠血浆中，判别了若干差别DARs的ADC和生物转化了的变异体（biotransformed variants，由于增添/删除了hexose, glutathione, cysteine以及linker-drug）。近年来，HR-MS在迅速度和质量区分率方面的提高，逐渐使其在定量生物剖析中得以有更普遍的应用。
Jian等人建设了IC-LC-QTOF-MS的事情流程，用于小鼠血浆中人类mAbs的绝对定量。定量的下限（LLOQ）为1000ng/mL（20 ?L血浆样品），并可降至250ng/mL，若是使用200?L样品。在优化其数据处置惩罚战略后，LLOQ降至50ng/mL。使用所述事情流程，Jian等人随后展示了GLP1-Fc融合卵白的定量；同时，在对小鼠的研究历程中，识别了该药物的两种主要卵白酶降解产品。
Lanshoeft等人验证了基于multiplex IC-LC-HRMS的PK定量要领，并用于非临床PK研究，该要领同时定量剖析了大鼠血清中两小我私家类IgG1。类似地，Jin等人在大鼠血清中定量了完整的trastuzumab emtansine（一种ADC）及其主要的DAR物种，其定量下限值约为20ng/mL，线性动态规模为5-100?g/mL。
另一个有趣的应用是最近Zhang等人报道的，在非变性LC条件下对native intact mAb举行的定量剖析，这可能为使用LC-HR-MS手艺以multiplex的方法建设团结（bound）/未团结（unbound）PK定量要领以及其它种种功效域PK的定量要领提供了时机。
毛细管Western Blot定量剖析要领
毛细管Western blot，也称为毛细管纳米免疫测定（capillary nanoimmunoassay，CNIA），已由制造商Protein Simple(San Jose, CA)商业化的Simple Western system，是指毛细管电泳免疫测定系统，它提供基于卵白质巨细和电荷的疏散名堂。与在疏散和检测之前举行配体团结的IC-LC-MS手艺差别，Western blot首先疏散卵白质，然后使用配体团结作为检测要领。因此，它能够使用multiplexed immunoassay，同时检测完整的卵白质及其生物转化的产品，并对变异的种种功效域举行表征。
现在，毛细管Western Blot定量剖析在卵白质药物的PK研究中应用仍然有限。Li等人在小鼠研究中验证了无浓缩的PK要领，以定量小鼠血浆中的polyhistidine N-和FLAG C-terminally-tagged重组卵白（约55kDa），其LLOQ为20ng/mL。Anti-FLAG tag抗体在immunoblot办法中用作初级抗体。研究发明，只需以1:100至1:500的比例稀释样品，即可消除基质中高品貌卵白的滋扰。
别的，Kodani等人使用capillary western blot检测到丙型肝炎病毒（HCV）的IgG抗体，批注其在抗药物抗体（ADA）检测方面的潜在应用。重组HCV卵白首先在毛细管中疏散和牢靠。稀释的人类血清随后在毛细管中孵育，使抗HCV抗体与牢靠的抗原团结。这一办法之后，使用抗人类IgG-HRP抗体再举行第二次孵育。在70个特表征优异的人血清样本的检测中，该要领与另一种市售的抗HCV抗体测试要领的相关性优异。
结论
为相识决双特异性分子开发历程中所需的生物剖析支持，本文讨论了在开发这些药物分子的PK剖析战略时一些奇异的思量。本文提出的战略和要领可以应用于双特异性分子和其它多域大分子药物，这需要对特定的药物分子其作用机制（MOA）和潜在的靶标生物学，以及评估PK/PD的所需要的数据有周全的相识。
大分子生物剖析行业需要新的定量剖析手艺来开发multiplexed PK定量要领，以便定量重大模式的药物及其生物转化产品。用于完整卵白质剖析的（IC-）LC-HR-MS和capillary Western blot手艺拥有很大应用远景，因其multiplexibility和提供目的待测物的多维信息（如分子量等电点和域功效/domain functionality）的能力。在已往几年中， HR-MS和capillary Western blot platforms的定量迅速度有了显著改善，只管这些手艺仍需要进一步改善，以获得更普遍的接受。目今HR-MS系统的一样平常操作相对简朴，但HR-MS（以及capillary Western blot）的数据剖析、诠释和验证，从羁系的角度看，还需要进一步明确。
从理想的和雄心壮志的角度思索，最好将PK/PD/免疫原性/生物转化的生物剖析整合到一个剖析测试要领之中，以镌汰药物开发所需的资源，并增进在统一组患者样本中周全剖析药物的PK/PD行为。设计和开发这样的定量剖析的要领，对每一种生物药结构都是奇异的，需要一种彻底的“适合其用途”的要领及其确认（confirmation）。为双（多）特异性分子开发可靠、稳健和可重现的PK剖析要领是很是具有挑战性的，由于多种因素会影响准确（accurate）而有意义（meaningful）的浓度测定值。未来生物剖析行业和羁系机构对指导定量剖析这些高度重大的生物（卵白）药的最佳做法的讨论和意见，将会极具价值。
未来远景
随着生物剖析要领的特异性、选择性和迅速度的一直提高，更准确（accurate）和更细密（precise）的测定双特异性抗体浓度和评估其在生物样品中的免疫原性将成为可能。预计双特异性和多特异性生物药的数目和种类将继续扩大，这将增进新的生物剖析要领的开发，以顺应这些分子的结构重大性和MOAs。
虽然，现在的要领将被用于新的卵白药物的定量。只管LBA要领是现在生物剖析要领的主要选择，并且在可以预见的未来仍将云云，LC-MS/MS要领，由于其与生俱来的multiplexed的定量剖析能力，可能会获得越发普遍地应用，以支持双特异性生物药的PK评估。LC-MS/MS比LBA剖析具有更少的剖析变异性（variability）和要害试剂的可及性（availability）问题。预期剖析实验室的自动化将扩展到生物剖析的所有阶段，以镌汰人工过失和提高数据质量。
特殊声明
本文若有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者谈论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经揭晓学术期刊、官方网络报道等果真渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择思量到多样化但也不可能完整�＝哟琳咛峁┯屑壑档奈南准捌淦拦�。
参 考 文 献
1.Zhu, L, et al. (2020). "Bioanalytical Challenges in Support of Complex Modalities of Antibody-Based Therapeutics." AAPS J 22(6): 130.
2.Ma, M., et al. (2019). "Bioanalytical challenges and unique considerations to support pharmacokinetic characterization of bispecific biotherapeutics." Bioanalysis 11(5): 427-435.
3.Seimetz D. Novel monoclonal antibodies for cancer treatment: the trifunctional antibody catumaxomab (removab). J. Cancer 2, 309–316 (2011).
4.Mullard A. Bispecific antibody pipeline moves beyond oncology. Nat. Rev. Drug Discov. 16(11), 666–668 (2017).
5.Diao L, Meibohm B. Tools for predicting the PK/PD of therapeutic proteins. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 11(7), 1115–1125 (2015).
6.Trivedi A, et al. Clinical pharmacology and translational aspects of bispecific antibodies. Clin. Transl. Sci. 10(3), 147–162 (2017).
7.Ezan E, et al. Assessment of the metabolism of therapeutic proteins and antibodies. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol.10(8), 1079–1091 (2014).
8.Fischer SK, et al. The assay design used for measurement of therapeutic antibody concentrations can affect pharmacokinetic parameters. Case studies. MAbs 4(5), 623–631 (2012).
9.Ruf P, et al. Pharmacokinetics, immunogenicity and bioactivity of the therapeutic antibody catumaxomab intraperitoneally administered to cancer patients. Br. J. Clin. Pharmacol. 69(6), 617–625 (2010).
10.Samineni D, et al. Impact of shed/soluble targets on the PK/PD of approved therapeutic monoclonal antibodies. Exp. Rev. Clin. Pharm. 9(12), 1557–1569 (2016).
11.Villegas VM, et al. Current advances in the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Expert Opin. Drug Deliv. 14(2), 273–282 (2017).
12.Ruppel J, et al. Preexisting antibodies to an F(ab’)2 antibody therapeutic and novel method for immunogenicity assessment. J. Immunol. Res. 2016, 1–8 (2016).
13.Fan X, et al. Lens glutathione homeostasis: discrepancies and gaps in knowledge standing in the way of novel therapeutic approaches. Exp. Eye Res. 156, 103–111 (2017).
14.Kang L, et al. LC-MS bioanalysis of intact proteins and peptides. Biomed Chromatogr. 2020;34(1):e4633. https://doi.org/10.1002/bmc.4633.
15.Chen, J, et al. "Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics." Journal of translational medicine 13: 182. (2015)
16.Murphy RE, et al. Combined use of immunoassay and twodimensional liquid chromatography mass spectrometry for the detection and identification of metabolites from biotherapeutic pharmacokinetic samples. J Pharmaceut Biomed.2010;53(3):221–7. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.04.028.
17.He JT, et al. High resolution accurate-mass mass spectrometry enabling in-depth characterization of in vivo biotransformations for intact antibody-drug conjugates. Anal Chem. 2017;89(10):5476–83.https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b00408.
18.Jian WY, et al. A workflow for absolute quantitation of large therapeutic proteins in biological samples at intact level using LC-HRMS. Bioanalysis.2016;8(16):1679–91. https://doi.org/10.4155/bio-2016-0096.
19.Lanshoeft C, et al. Generic hybrid ligand binding assay liquid chromatography high resolution mass spectrometry based workflow for multiplexed human immunoglobulin G1 quantification at the intact protein level: application to preclinical pharmacokinetic studies. Anal Chem. 2017;89(4):2628–35. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b04997.
20.Jin W, et al. LC-HRMS quantitation of intact antibody drug conjugate trastuzumab emtansine from rat plasma. Bioanalysis. 2018;10(11):851–62. https://doi.org/10.4155/bio-2018-0003.
21.Zhang LY, et al. Top-down LC-MS quantitation of intact denatured and native monoclonal antibodies in biological samples. Bioanalysis. 2018;10(13):1039–54. https://doi.org/10.4155/bio-2017-0282.
22.Li Y, et al. An efficient and quantitative assay for epitope-tagged therapeutic protein development with a capillary western system. Bioanalysis. 2019;11(6):471–84. https://doi.org/10.4155/bio-2018-0248.
23.Kodani M, et al. An automated immunoblot method for detection of IgG antibodies to hepatitis C virus: a potential supplemental antibody confirmatory assay. J Clin Microbiol. 2019;57(3). https://doi.org/10.1128/JCM.01567-18.
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